La vicenda narra la storia di Sydney Bristow, recluta per un'agenzia segreta della CIA.
Ora però qualcosa nel suo futuro sta sicuramente per cambiare quando il fidanzato Danny le chiede di sposarla...
Che fare? Raccontargli la sua vera vita e toglierli l'idea di lei, una semplice studente universitaria...
Il suo partner alla SD-6, Dixon, le ricorda che è vietato divulgare il loro vero impiego, ma per amore infrange la regola e da qui il suo futuro cambia inesorabilmente...
Danny viene ucciso nella sua vasca da bagno e il fatto di aver parlato dell'SD-6, mette Sydney in pericolo.

Jack, il padre che anch'esso fa parte dell'SD-6, le rivela il pericolo che sta correndo e le dice che l'SD-6 non è una divisione della CIA, ma anzi lavora contro la CIA ed attenta ogni giorno alla sicurezza degli Stati Uniti.
Sconcertata da questa rivelazione, Sydney si rivolge alla CIA stessa per così poter aiutarli a sgominare la sua associazione e le altre agenzie sparse per il mondo.

Il compito di Sydney si complicherà in quanto diventerà un'agente doppiogiochista: dovrà continuare a lavorare per l'SD-6, ma passare tutte le informazioni alla CIA.
Per questo compito le verrà affidato un'agente di riferimento: Michael.
Ma per fortuna non sarà sola nell'opera, in quanto anche suo padre è un'agente doppiogiochista come lei.

Riuscita finalmente ad eliminare l'SD-6 e la pericolosa Alleanza dei Dodici grazie alle informazioni contenute nel misterioso Server 47, Sydney si rende conto che si è trattato di un piano ordito da Arvin Sloane, il suo capo all'SD-6.
Ora Sloane grazie all'aiuto del sig. Sark può continuare la sua ricerca personale sul segreto racchiuso nei manufatti di Milo Rambaldi, un'inventore italiano.
Al fine di poter agire indisturbati e sapere i movimenti della CIA, Francie, la cara amica di Sydney e sua compagna di casa, viene sostituita da una copia, a sua insaputa..

Però dopo varie azioni e attacchi, Sydney e i suoi compagni alla CIA, riescono a sgominare l'Alleanza ed assicurare Sloane alla giustizia..
Sloane ha comunque avuto la possibilità di ricostruire “il Dire” , un macchianario di Rambaldi creato dai 47 manufatti di Rambaldi stesso, recuperati nel corso dei suoi anni, che gli ha comunicato un messaggio..
In queste missioni Sydney scopre e conosce la madre Irina, che credeva morta da bambina, ma che è sempre stata un'agente segreto dell'ex-KGB.

Sydney poi, scoperta la morta della vera Francie, ingaggia con lei una lotta fra le mura domestiche, avendone però la meglio.. Esausta crolla a terra, ma al suo risveglio si trova ad Hong Kong..

Contattando la CIA, scopre che in realtà sono passati due anni e che Michael, che nel frattempo era diventato il suo fidanzato, si è sposato credendola morta..

Lavorando ancora per la CIA dopo il suo ritorno oltre i suoi amici, ritrova Sloane apparentemente redento per il male compiuto e Lauren, agente del Consiglio di Sicurezza Nazionale ma anche moglie di Michael.
Le sue azioni e quelle della CIA saranno rivolte a sgominare la Convenzione: un cartello criminale dedito ad impossessarsi di armi e denaro..
Nel corso delle sue indagini e grazie all'aiuto del padre, Sydney scopre che in quei due anni ha preso l'identità di “Julia Thorne” e con il bene placido della CIA si è infiltrata fra le file della Convenzione lavorando da doppiogiochista, ma al suo rientro ha subito volontariamente un lavaggio del cervello quando ha rinvenuto un pericolosissimo reperto di Rambaldi..

Nel frattempo una minaccia interna si profila quando Lauren si scopre essere un'agente della Convenzione infiltrata nella CIA, che in coppia con Sark finirà per diventare il capo della cellula nord-americana di queto cartello terroristico.
Sloane, invece, rivela i suoi veri interessi quando, grazie alle parole rivelate dal Dire di Rambaldi, viene ritrovata Nadia figlia che l'uomo ha avuto durante una relazione segreta con Irina: Nadia si scopre essere il “Passeggero” di Rambaldi, che dovrebbe fronteggiare la "Prescelta", sua sorella Sydney..
Tramite Nadia, Sloane cerca di recuperare la “Sfera della Vita”, un manufatto che contiene la coscienza di Rambaldi..
Michael invece, scoperto il tradimento della moglie la uccide, ma Lauren ha il tempo per dare a Sydney il numero di una cassetta di sicurezza dalla quale poter aver informazioni sul suo passato.

Dai documenti segreti ritrovati Sydney viene a scoprire un misterioso Progetto S.A.B. 47, con cui ha a che fare suo padre Jack...

Irina intanto viene uccisa dal padre, ma una nuova era è giunta, quando Sydney lascia la CIA, ed entra a far parte della nuova divisione APO (Solo Personale Autorizzato), ritrovando tutta la sua squadra e la sorella Nadia.
La nuova agenzia è a capo dell'acerrimo nemico di Sydney: Arvin Slaone..